儲運條件

長期保存請于-20℃避光保存，Mix 融解后可在4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個月，盡量避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品組分

Universal SYBR Green qPCR Mix 

產(chǎn)品簡介

Universal SYBR Green qPCR Mix 是SYBR® Green I 嵌合染料法專用qPCR 試劑，為2× 預(yù)混液，包含除引物和DNA 樣品以外的所有qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動Taq DNA 聚合酶，配合精心優(yōu)化的Buffer 體系以及PCR 反應(yīng)促進(jìn)因子，使產(chǎn)品具有特異性強、擴(kuò)增效率高等特點，有效抑制非特異性擴(kuò)增，可對寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的qPCR 結(jié)果。預(yù)混液中含有通用校正染料，與絕大多數(shù) qPCR 設(shè)備兼容，包括需要 ROX 校正的儀器，實驗過程中一般不需要額外添加校正染料。

使用方法

1. 使用注意

① 因Mix 中預(yù)混有染料，其保存或反應(yīng)體系配制過程應(yīng)避免強光照射；

② 使用前上下顛倒輕輕混勻Mix，請勿渦旋振蕩混勻，避免產(chǎn)生過多氣泡;

③ Mix 中含有Universal 校正染料，適用于所有機型，無需額外添加染料。

2. 建議的qPCR 反應(yīng)體系

a. 通常推薦的引物終濃度為0.2 μM，反應(yīng)效果不佳時可在0.1~1 μM 范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整；

b. 推薦模板加樣量為1~2 μl，如模板類型為未稀釋cDNA 原液，模板添加量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%。不同種類DNA 模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同，必要時可進(jìn)行梯度稀釋，以確定最佳的DNA 模板添加量。

3. qPCR 反應(yīng)程序（可根據(jù)機型適當(dāng)調(diào)整）Universal SYBR Green qPCR Mix

兩步法

三步法

a. 根據(jù)引物的Tm 值進(jìn)行退火& 延伸（退火）溫度的設(shè)定；若擴(kuò)增片段在200bp 以內(nèi)，退火& 延伸（延伸）時間可以設(shè)置為15 sec；此外，退火& 延伸（延伸）時間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的qPCR 儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整；

b. 不同qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別，一般可使用儀器默認(rèn)的熔解曲線采集程序。

4. 實驗優(yōu)化

若使用默認(rèn)反應(yīng)條件反應(yīng)性能不佳時，則需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，可以從引物濃度以及擴(kuò)增程序兩個方面進(jìn)行：

① 引物濃度調(diào)整

當(dāng)引物終濃度在0.1~1.0 μM 范圍之間變化時，引物濃度越低，擴(kuò)增特異性越高，但擴(kuò)增效率會有所下降。

② 擴(kuò)增程序優(yōu)化

需提高擴(kuò)增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴(kuò)增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。

5. 引物設(shè)計原則

① 擴(kuò)增產(chǎn)物長度建議控制在80~200 bp；

② 引物長度為18~25 bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm 值相差不超過1℃為佳，Tm 值控制在58~62℃為佳；

④ 引物的GC 含量控制在40%~60% 之間；

⑤ 引物A、G、C、T 整體分布盡量要均勻，避開T/C 或者A/G 的連續(xù)結(jié)構(gòu)（特別是3' 端）；

⑥ 引物3' 端最后一個堿基最好為G 或者C；

⑦ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補序列；

⑧ 使用NCBI BLAST 功能檢索確認(rèn)引物的特異性。

美國Azaood公司成立于2004年，是一家開發(fā)和生產(chǎn)用于生命科學(xué)研究、診斷和生物技術(shù)應(yīng)用的高質(zhì)量純化酶、蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞分離試劑盒、胎牛血清的lingdao者；Azood公司是通過了ISO9001認(rèn)證的主要制造商，可以滿足從研究到大規(guī)模批量生物加工和OEM應(yīng)用與要求的公司。