產(chǎn)品貨號：AV1501-B

產(chǎn)品名稱：人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞擴增培養(yǎng)試劑盒

Human urine-derived mesenchymal stem cell expansion kit

人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞擴增培養(yǎng)試劑盒產(chǎn)品描述

該試劑盒為經(jīng)過優(yōu)化的低血清(2%V/V )尿源間充質(zhì)干細(xì)胞( Urine-derived mesenchymal stem cell,USC)體外擴增培養(yǎng)基。低血清降低了胎牛血清對尿源干細(xì)胞特性和分化的不利影響,穩(wěn)定性更加，適用于實驗室科研。生長因子、激素的聯(lián)合應(yīng)用維持了干細(xì)胞特性及旺盛的細(xì)胞增殖能力，配合人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞分離試劑盒可在短時間內(nèi)收獲大量細(xì)胞。

產(chǎn)品內(nèi)容

使用說明

人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞擴增*培養(yǎng)基的配制:

將擴增培養(yǎng)基添加劑置于2- -8C環(huán)境中過夜解凍直至*溶解，混合均勻，與擴增基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合配置為500mL人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞擴增*培養(yǎng)基

注意事項:

●配好后避光2- -8C保存，4周內(nèi)使用完畢

●所有產(chǎn)品請于保質(zhì)期內(nèi)使用，超過保質(zhì)期，必須放棄使用

●為確保產(chǎn)品質(zhì)量，請避免反復(fù)凍融相關(guān)產(chǎn)品

1、人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞(USC)擴增與傳代:

1)細(xì)胞隔天換液，待鏡下細(xì)胞融合率達(dá)80%~90%，即可消化傳代

2)室溫0.25% EDTA-胰酶消化USC (一般不超過1min)，鏡下觀察，待細(xì)胞邊緣透亮、變圓時，加入適量USC擴增培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，重懸細(xì)胞

3) 1200rpm, 4min離心

4)棄上清, USC擴增培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:4比例接種至培養(yǎng)皿，進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)

注意事項:

●USC細(xì)胞生長速率較快，待細(xì)胞融合率達(dá)80~90%或內(nèi)部生長空間較小時即可進(jìn)行消化傳代，因干細(xì)胞接觸抑制易影響其增殖活力。

●本培養(yǎng)基可體外擴增USC至10代左右，代數(shù)增加會加速細(xì)胞老化，細(xì)胞實驗盡量在P7代前進(jìn)行,分化實驗盡量取代數(shù)較早細(xì)胞(P3代左右)進(jìn)行。

2、USC凍存

1)配制凍存液: DMSO:血清= 200u: 800ul

2) 0.25% EDTA-胰酶消化USC 1分鐘左右，加入3- 5ml USC擴增培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻細(xì)胞懸液

3) 1200rpm, 4min離心

4)棄上清,加500ul USC擴增培養(yǎng)基重懸

5)將1ml凍存液逐滴緩慢加入細(xì)胞懸液，混勻后轉(zhuǎn)移進(jìn)冷凍管中，總體系1.5mL

6)標(biāo)記名稱、代數(shù)、日期，封好封口膜，放入梯度凍存盒

7)將凍存盒放入-809C, 24小時后(第二天)轉(zhuǎn)入液氮保存

注意事項:

●慢凍速溶，凍存細(xì)胞緩慢梯度降溫，可配合使用梯度凍存盒，-809C凍存后盡早轉(zhuǎn)入液氮保存

3、USC復(fù)蘇

1) 379C水浴鍋打開備用

2)從液氮取出細(xì)胞，放入水浴鍋速溶，時間控制在1分半鐘內(nèi)

3)將凍存管內(nèi)液體緩慢加入5ml USC擴增培養(yǎng)基內(nèi),吹打混勻

4) 1200rpm, 4min離心

5)棄上清,加入適量USC擴增培養(yǎng)基，接種至培養(yǎng)皿

6)復(fù)蘇24小時后(第二天)全換液

注意事項:

●慢凍速溶，復(fù)蘇細(xì)胞水浴時間盡量控制在一-分半鐘，可晃動加速溶解

●復(fù)蘇后第二天(細(xì)胞貼壁后)盡早全換液，減少DMSO對細(xì)胞的毒性損傷

●為保證細(xì)胞活力，請避免反復(fù)凍融細(xì)胞

本尿源間充質(zhì)干細(xì)胞擴增培養(yǎng)基已經(jīng)過人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞性能測試，詳見附圖(3, 4, 5)

質(zhì)量控制

√無菌檢測(細(xì)菌、真菌和支原體檢測)

√pH測試

√滲透壓檢測

√內(nèi)毒素檢測

附圖3人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴增傳代圖片(光鏡: 100X )

附圖4人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定

CD29、CD73、CD90、CD44等間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)特異性表面標(biāo)記物強陽性表達(dá)，SSEA-4多潛能干性標(biāo)記物強陽性表達(dá)，造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞來源的標(biāo)記物CD45、CD34、CD31、HLA-DR等均陰性，鑒定其為MSC來源

附圖5人尿源間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)后向脂肪、成骨、軟骨細(xì)胞分化

成骨: ALP+;茜素紅+; RUNX2、OCN+

成脂:脂滴+;油紅O+

成軟骨:甲苯胺藍(lán)+; SOX9、COL II+

References

1.Zhang,Y.,et a1.(2008). Urine Derived Cells are a Potential Source for Urological Tissue Reconstruction. J urol

180(5):2226- -33.

2. Zhou,T,et al.(2012).Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Portoc

7(12):2080-9.

3.Bharadwaj,S. ,et al (2013).Multipotential differentiation of human urine- -derived stem cells: potential for

therapeutic applications in urology.Stem Cells 31(9):1840-56.

4.Ji,X,et al.(2017).Urine-Derived Stem Cells: The Present and the Future.Stem Cells Int 2017:4378947.

5.Falzarano,M.S.,et al.(2019).Urinary Stem Cells as Tools to Study Genetic Discase: Overview of the Literature.J

Clin Med 8(5). pil: E627.

6.Wang,L.,et al.(2013).Generation of integration- -free neural progenitor cells from cells in human urine.Nat

Methods 10(1):84- -9.

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