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優化、培養原代LYCO和LYCT細胞條件技術分享

原文標題：Establishment and characterization of the gonadal cell lines derived from large yellow croaker (Larimichthys crocea) for gene expression studies.

 Doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737300

發表文章單位：集美大學水產學院農業農村部東海海水健康養殖重點實驗室     

背景：魚類細胞系在資源保護、遺傳育種、疾病防治、環境污染物檢測等方面具有重要的應用價值。性腺細胞系的建立將為研究性別決定的分子調控機制以及性別相關基因的表達和功能提供合適的體外模型。

方法：采用改良Leibovitz L-15培養基，從幼魚的卵巢和精巢中分別建立了大黃魚卵巢細胞系（LYCO）和精巢細胞系（LYCT）。再通過優化培養基條件以提高LYCO和LYCT的生長速度和增殖能力，包括ZETA-life胎牛血清（FBS）濃度、不同傳代比例、凍存和復蘇等。

結果：采用電穿孔法成功地將pEGFP-N1和pNanog-N1轉染到細胞系中，細胞的轉染效率較高，表明該細胞系可用于研究外源基因和內源基因的表達。LYCO表達卵泡細胞的標記基因Foxl 2，而LYCT表達睪丸支持細胞的標記基因Dmrt 1，且LYCO和LYCT不表達生殖細胞標志基因Vasa。表明LYCO和LYCT分別由卵泡細胞和睪丸支持細胞組成。在LYCO和LYCT中分別敲低Dmrt 1和Foxl 2后，獲得的細胞系可有效用于RNA介導的干擾（RNAi）實驗和基因間相互作用的研究。

結論：作為第一個獲得的魚類性腺細胞系。本研究為大黃魚體細胞與生殖細胞的相互作用提供了一種新的模型，為大黃魚生殖細胞的進一步研究奠定了基礎。本研究結果為今后海水魚類性腺細胞培養的研究奠定了基礎。
文章引用：

Primary culture and subculture

When the primary cells were fully expanded, the subculture was started with a 0.25% trypsin digestion method, and the cell culture bottle was gently turned back and forth. The trypsin was sucked out after most of the cells became round, then 3 mL of new culture medium and 2mL of old culture medium were added again. The cells were gently transferred to the new culture bottle for constant temperature culture.The FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500) concentration remained at 16.7% in the early stage of cell culture and gradually decreased to 10% FBS when the cells were passed to passage 20 (P20),and the morphology turned good. During the first 30 subcultures, the cells were split at a ratio of 1:2 every 2–3 days.    

結果引用:

以澳洲胎牛血清FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)血清進行的LYCO和LYCT的原代培養.A和B分別表示第2天和第5天的LYCO原代培養細胞; C和D分別表示第5天和第7天的LYCT原代培養細胞。隨著傳代的進行，LYCO主要由卵巢體細胞和生殖細胞（卵細胞等）組成。繼代培養后，LYCT的形態沒有明顯變化，擴增速度加快。3-4 d內子代細胞覆蓋率達100%。目前，細胞已穩定傳代至第80代（P80）。

E和F分別顯示在LYCO和LYCT中用pNanog-N1轉染后的綠色熒光蛋白（GFP）。檢測到強烈的綠色熒光信號，證明轉染效率高。G表示用不同濃度的澳洲胎牛血清FBS(Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)培養LYCO和LYCT。發現細胞幾乎不在含0%和5%FBS的培養基中擴增。當FBS濃度為10%、15%、20%時，細胞能正常生長并充分增殖。當FBS濃度為15%或20%時，細胞迅速擴增，覆蓋率可達90%。因此，在早期細胞培養中，可選擇含15%或20% FBS的培養基。

原文培養原代大黃魚卵巢細胞（LYCO）和大黃魚精巢細胞（LYCT）方法總結
通過優化培養基條件以提高LYCO和LYCT的生長速度和增殖能力。其中包括使用不同濃度的胎牛血清（FBS，Zeta life, Australia Origin, Z7010FBS-500）來進行優化，為研究出最佳LYCO和LYCT的生長速度和增殖能力提供可靠數據。研究證明當FBS濃度為15%或20%時，細胞迅速擴增，覆蓋率可達90%。因此，在早期細胞培養中，可選擇含15%或20% FBS的培養基。

引用產品

胎牛血清fetal bovine serum (Zeta life, USA) ；

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ZETA life FBS（胎牛血清）簡介：
  美國ZETA life公司成立于1989年，是國際無血清細胞培養基DMEM/F12主要完成人，有幾十年的胎牛血清、無血清細胞培養基、以及干細胞、免疫細胞及腫瘤細胞等多種不同類型哺乳動物細胞的無血清培養液生產經驗；ZETA life也是目前世界胎牛血清、無血清培養基最大的OEM供應商之一；每批血清均有完整的血源證明文件、獸醫師檢驗證明及品質測試報告；ZETA life胎牛血清在100級的無菌間采用全自動方式制造生產，具有良好的可再現性及可追溯性。